产品目录

本试剂盒适用于快速提取普通动物细胞和易裂解动物组织总RNA，使用独特的基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录荧光定量PCR，Northern-blot等下游实验。

本试剂盒采用独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚、氯仿、β巯基乙醇等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个细胞样品操作一般可在15分钟内完成。
  
• 基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达2.1-2.2。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温(4℃或-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温(15～25℃)下进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的台式离心机即可。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3～10⁶细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3～4×10⁶，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
  
• 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
    • 将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒采取了百奥莱博独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时应注意以下几方面。
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系百奥莱博公司索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系百奥莱博公司索取具体操作说明书（微量DNA柱式吸附清除试剂盒）。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2kb和1kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了，还是提取出来的RNA是完好的，只是在电泳过程中降解的。
    
  • 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在2.1～2.2之间100%纯的RNA比值一般是2.2左右。
    
    • 100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多，造成比值降低，无法达到2.2这个纯度标准，因此降低要求1.9～2.0就凑合使用了，但本试剂盒标准一般可以达到高水准的2.1～2.2的纯度标准。
      
    • OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测量使用的机器影响，也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释，不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品，如果测量的时候机器要求稀释后测量，假定在10mM Tris(pH7.5)稀释溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.9～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀、OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

• 培养细胞
  
  • 贴壁细胞：不需消化，彻底吸干净培养液后直接加裂解液RLT Plus(见附录一)反复吹打细胞裂解，接步骤1.e。
    
    • 不方便直接裂解的培养容器，可用刮下细胞，或胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5mL离心管，接步骤1.c。
  • 悬浮细胞：收集<10⁷悬浮细胞到一个1.5mL离心管。
    
  • 13000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
    
  • 轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加350μL（<5×10⁶细胞）或600μL（5×10⁶～1×10⁷细胞）裂解液RLT Plus，用移液器反复吹打充分裂解(直到看不细胞团为止)。
    
  • 将裂解混合物全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
    
  • 立刻接操作步骤项下3。
• 动物组织（例如鼠肝脑）
  
  • 匀浆器匀浆：新鲜组织加入350μL(<20mg组织)或者600μL(20～30mg组织)的裂解液RLT Plus后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。
    
  • 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μL/600μL组织裂解液RLT Plus的1.5mL离心管中，剧烈振荡20秒，难裂解样品可用移液器反复吹打匀浆。
    
    • 若研磨匀浆后不溶物碎片太多，可将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。将上清液加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
  • 将研磨均匀的匀浆液全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
    
  • 立刻接操作步骤项下3。
• 立刻13000rpm离心1分钟，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
  
  • 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
• 较精确估计滤过液体积（通常为350μL/600μL，滤过时候损失体积应该减去，可用移液器吸取滤液估计体积），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中（吸附柱放入收集管中），13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，13，000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个干净1.5mL离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water，室温放置1分钟，13000rpm离心1分钟得到RNA溶液。
  
  • 洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的RNA，将离心得到的RNA溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。

• 一般情况下，3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350μL裂解液RLT Plus，6cm直径培养皿或者更大培养容器加600μL裂解液RLT Plus。最大处理量不超过10⁷个细胞。