产品货号：
ALH019
中文名称：
组织细胞总RNA提取试剂盒
英文名称：
Total RNA Extraction Kit From Cell & Tissue
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
询价
本试剂盒适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA，是在无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又采用基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
试剂盒组分：
储存：
注意事项：
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
附录一：贴壁培养细胞数量表
注：一般情况下，3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350μl裂解液RLT Plus，6cm直径培养皿或者更大培养容器加600μl裂解液RLT Plus。最大处理量不超过107个细胞。
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产品特点：
- 完全不使用有毒的苯酚，氯仿，β巯基乙醇等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
- 快速，简捷，单个细胞样品操作一般可在15分钟内完成。
- 基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
- 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多，造成比值降低，无法达到2.2这个纯度标准，因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了，但是本试剂盒的产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准）。
试剂盒组分：
| 组份 | 50次 |
| 裂解液RLT Plus | 50ml |
| 去蛋白液RW1 | 40ml |
| 漂洗液RW | 10ml (第一次使用前按说明加指定量乙醇) |
| RNase-free H2O | 10ml |
| 70%乙醇 | 9ml (第一次使用前按说明加指定量乙醇) |
| 基因组DNA清除柱和收集管 | 50套 |
| 吸附柱和收集管 | 50套 |
储存：
- 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
- 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
- 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
注意事项：
- 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的台式离心机即可。
- 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3×106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3～4×106，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
- 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 预防RNase污染，应注意以下几方面：
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
- 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
- RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
- 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
- 关于DNA的微量残留：
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本试剂盒由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：- 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
- 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
- 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书（我公司微量DNA柱式吸附清除试剂盒，货号：ALH432）。
- 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- RNA纯度及浓度检测：
完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2 kb和1kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了，还是提取出来的RNA是完好的，只是在电泳过程中降解的。
纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数在2.1-2.2之间100%纯的RNA比值一般是2.2左右（100%纯的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多，造成比值降低，无法达到2.2这个纯度标准，因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了，但是我公司的产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准）。OD260/OD280读数受测量使用的机器影响，也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释，不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品，如果测量的时候机器要求稀释后测量，假定在10mM Tris，pH7.5稀释溶液中测出的OD260/OD280读数1.9-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260,OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
- 培养细胞
- 贴壁细胞：不需消化，彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液RLT Plus （见附录一）反复吹打细胞裂解；不方便直接裂解的培养容器，可以用细胞刮子刮下细胞，或者胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5ml离心管。
悬浮细胞：收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。 - 13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
- 轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加350μl（<5×106细胞）或600μl （5×106～1×107细胞）裂解液RLT Plus，用移液器反复吹打充分裂解(直到看不细胞团为止)。
- 将裂解混合物全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
- 立刻接操作步骤项下3。
- 贴壁细胞：不需消化，彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液RLT Plus （见附录一）反复吹打细胞裂解；不方便直接裂解的培养容器，可以用细胞刮子刮下细胞，或者胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5ml离心管。
- 动物组织（例如鼠肝脑）
- 匀浆器匀浆：新鲜组织加入350μl(<20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT Plus后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。
液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT Plus的1.5ml离心管中，剧烈振荡20秒，难裂解样品可用移液器反复吹打匀浆。
注意：若研磨匀浆后不溶物碎片太多，可将匀浆后裂解物13，000rpm离心3分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。将上清液加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。 - 将研磨均匀的匀浆液全部加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
- 立刻接操作步骤项下3。
- 匀浆器匀浆：新鲜组织加入350μl(<20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT Plus后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。
- 立刻13,000rpm离心1分钟，保留滤过液（RNA在滤过液中）。
确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。 - 较精确估计滤过液体积（通常为350μl/600μl，滤过时候损失体积应该减去，可用移液器吸取滤液估计体积），加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
- 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，弃掉废液。
- 加700μl去蛋白液RW1，室温放置30秒，13，000rpm离心30秒，弃掉废液。
- 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。
- 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱RA，放入一个干净1.5ml离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water，室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟得到RNA溶液。
洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的RNA，将离心得到的RNA溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。
附录一：贴壁培养细胞数量表
| 培养器皿 | 底面积（cm2） | 加培养液量（ml） | 可获细胞量 |
| 24孔培养板 | 2 | 1 | 5×105 |
| 6孔培养板 | 9.6 | 2.5 | 2.5×106 |
| 3.5cm培养皿 | 8 | 3 | 2.0×106 |
| 6cm培养皿 | 21 | 5 | 5.2×106 |
| 25cm塑料培养瓶 | 25 | 5 | 5.2×106 |
| 100ml玻璃培养瓶 | 33 | 10 | 7×106 |
注：一般情况下，3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350μl裂解液RLT Plus，6cm直径培养皿或者更大培养容器加600μl裂解液RLT Plus。最大处理量不超过107个细胞。
相关搜索：组织细胞总RNA提取试剂盒，组织总RNA提取试剂盒，组织总RNA分离试剂盒，组织总RNA纯化试剂盒，细胞总RNA提取试剂盒，细胞总RNA分离试剂盒，组织总RNA纯化试剂盒，Total RNA Extraction Kit From Cell & Tissue